高效液相色譜儀的使用注意事項(xiàng)
高效液相色譜儀（HPLC）的使用涉及精密部件與復(fù)雜流程，操作不當(dāng)易導(dǎo)致儀器故障或數(shù)據(jù)偏差。以下從流動(dòng)相制備、儀器操作、樣品處理等維度，梳理核心注意事項(xiàng)及風(fēng)險(xiǎn)規(guī)避策略：
試劑選擇：使用 HPLC 級(jí)溶劑（如乙腈、甲醇），避免分析純?cè)噭┲械碾s質(zhì)污染色譜柱或檢測(cè)器（雜質(zhì)可能在 UV 檢測(cè)中產(chǎn)生假峰）。
脫氣處理：流動(dòng)相需經(jīng)超聲脫氣 15-30 分鐘（或使用在線脫氣機(jī)），未脫氣的流動(dòng)相可能導(dǎo)致泵壓力波動(dòng)、檢測(cè)器基線漂移或氣泡堵塞管路。
過(guò)濾強(qiáng)制要求：水相需用 0.22μm 或 0.45μm 微孔濾膜過(guò)濾（去除微生物或顆粒雜質(zhì)），有機(jī)相可選用尼龍膜或 PTFE 膜，混合流動(dòng)相應(yīng)先過(guò)濾再混合（避免鹽類析出）。
濃度與 pH 限制：緩沖鹽濃度不宜超過(guò) 0.1M（如磷酸鹽緩沖液＞0.05M 時(shí)易結(jié)晶），流動(dòng)相 pH 需在色譜柱耐受范圍（通常反相柱 pH 2-8，柱可至 pH 1-12），超出范圍會(huì)導(dǎo)致固定相流失或硅膠基質(zhì)溶解。
梯度洗脫注意：含緩沖鹽的流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，需確保有機(jī)相比例緩慢增加（如乙腈從 5% 升至 95% 的時(shí)間≥10 分鐘），避免鹽類在高有機(jī)相條件下析出堵塞管路。
使用后沖洗：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，必須用 10% 甲醇 / 水以 0.5-1.0mL/min 流速?zèng)_洗泵和色譜柱 30-60 分鐘（去除緩沖鹽），禁止直接用純有機(jī)相沖洗含緩沖鹽的系統(tǒng)（鹽結(jié)晶會(huì)損壞泵頭和色譜柱）。
開機(jī)流程：先開啟泵、柱溫箱、檢測(cè)器等硬件設(shè)備，再啟動(dòng)工作站軟件（避免軟件與硬件通訊故障）；UV 檢測(cè)器需預(yù)熱 30 分鐘以上（氘燈穩(wěn)定），示差折光檢測(cè)器（RID）需預(yù)熱 1-2 小時(shí)（溫控系統(tǒng)穩(wěn)定）。
壓力初始化檢查：開機(jī)后以低流速（0.3-0.5mL/min）沖洗系統(tǒng) 10 分鐘，觀察壓力是否穩(wěn)定（初始?jí)毫?yīng)與歷史數(shù)據(jù)偏差＜10%），若壓力驟升可能是管路堵塞（如過(guò)濾器或色譜柱入口污染），壓力驟降需檢查泵是否漏氣或單向閥失效。
溶解與過(guò)濾：樣品需用流動(dòng)相或相近極性溶劑溶解（避免溶劑效應(yīng)導(dǎo)致峰展寬或裂峰），并用 0.22μm 濾膜過(guò)濾（尤其是生物樣品、中藥提取物等復(fù)雜基質(zhì)，未過(guò)濾的顆粒會(huì)堵塞進(jìn)樣針或色譜柱）。
濃度與進(jìn)樣量控制：樣品濃度不宜過(guò)高（避免色譜柱過(guò)載導(dǎo)致峰形畸變），常規(guī)反相色譜進(jìn)樣量建議≤20μL（根據(jù)柱徑調(diào)整，如 4.6mm 柱建議 10-20μL），大體積進(jìn)樣需配合預(yù)柱保護(hù)。
手動(dòng)進(jìn)樣閥使用：進(jìn)樣時(shí)需確保閥位切換到位（如六通閥從 “LOAD" 到 “INJECT" 需快速旋轉(zhuǎn)），避免在切換過(guò)程中漏液或樣品殘留；進(jìn)樣針使用后需立即用洗針液清洗（如甲醇 / 水 = 3:1），防止高粘度樣品凝固堵塞針孔。
自動(dòng)進(jìn)樣器維護(hù)：樣品盤需保持干燥清潔，避免樣品瓶漏液污染進(jìn)樣針座；洗針液需定期更換（建議每天更換一次），防止微生物滋生或雜質(zhì)沉積。
安裝方向：色譜柱需按標(biāo)識(shí)方向連接（反相柱通常箭頭指向檢測(cè)器），反向使用會(huì)導(dǎo)致柱效急劇下降（固定相坍塌）；連接管路時(shí)需確保接口無(wú)漏液（手緊后再用扳手輕擰 1/4 圈，避免過(guò)緊損壞螺紋）。
使用前預(yù)處理：新柱使用前需用 10 倍柱體積的初始流動(dòng)相平衡（如方法流動(dòng)相為甲醇 / 水 = 70:30，先用 5% 甲醇 / 水沖洗 10 分鐘，再逐步升高有機(jī)相比例），避免流動(dòng)相組成突變導(dǎo)致柱床塌陷。
溫度與壓力限制：色譜柱使用溫度通?！?0℃（高溫會(huì)加速固定相流失），操作壓力需＜色譜柱最高耐受壓力（如常規(guī) C18 柱耐受壓力≤400bar），壓力過(guò)高時(shí)需立即停機(jī)排查（可能因柱入口堵塞或流動(dòng)相粘度異常）。
保護(hù)柱使用：分析復(fù)雜樣品時(shí)需加裝保護(hù)柱（如 C18 保護(hù)柱），保護(hù)柱與分析柱需同品牌同型號(hào)，定期更換保護(hù)柱（通常每分析 50-100 個(gè)樣品后更換），避免污染物進(jìn)入分析柱。
波長(zhǎng)選擇與燈源保護(hù)：檢測(cè)波長(zhǎng)需避開流動(dòng)相截止波長(zhǎng)（如甲醇截止波長(zhǎng) 205nm，乙腈 190nm），避免基線噪聲增大；氘燈開關(guān)頻率不宜過(guò)高（每天開關(guān)≤1 次），超過(guò)使用壽命（2000 小時(shí)）需及時(shí)更換，否則影響檢測(cè)靈敏度。
流通池維護(hù)：避免長(zhǎng)時(shí)間分析強(qiáng)保留樣品（如蛋白質(zhì)、色素），防止流通池污染；若基線出現(xiàn)異常波動(dòng)或鬼峰，需立即用 10% 硝酸水溶液沖洗流通池（注意流速≤0.1mL/min，防止壓力過(guò)高損壞池體）。
漏液處理：發(fā)現(xiàn)泵頭、進(jìn)樣閥或管路漏液時(shí)，立即停機(jī)并切斷電源，用吸水紙清理液體，檢查密封墊、管路接口或密封圈是否損壞（如泵密封墊磨損需及時(shí)更換）。
壓力異常：壓力突然升高時(shí)，先檢查過(guò)濾器（入口濾頭或在線過(guò)濾器）是否堵塞（可超聲清洗或更換），若壓力持續(xù)異?？赡苁巧V柱污染，需用高比例水相低速?zèng)_洗（如反相柱用 90% 水 / 10% 甲醇以 0.3mL/min 沖洗 2 小時(shí)），切勿強(qiáng)行提高流速。
HPLC 使用需遵循 “預(yù)防優(yōu)先、規(guī)范操作" 原則，核心注意事項(xiàng)可歸納為：
流動(dòng)相管理：嚴(yán)格過(guò)濾脫氣，緩沖鹽使用后必須沖洗；
色譜柱保護(hù)：避免溫度、壓力超限，復(fù)雜樣品需用保護(hù)柱；
檢測(cè)器維護(hù)：UV 燈源避免頻繁開關(guān)，RID 需嚴(yán)格控溫脫氣；
安全意識(shí)：有機(jī)溶劑操作需通風(fēng)，故障時(shí)先停機(jī)再排查。
規(guī)范操作可降低儀器故障率，同時(shí)保證分析數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性與重復(fù)性，延長(zhǎng)設(shè)備使用壽命
高效液相色譜儀的使用離不開這個(gè)情況
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